Dénombrement des bactéries coliformes et des Coliformes thermotolérants

  
Dernière mise à jour : 6 mai 1999

Objectifs

Evaluer la qualité bactériologique d'une eau par recherche de Coliformes. Il existe en effet une corrélation entre la présence de bactéries coliformes, témoins de la contamination fécale, et la présence de bactéries pathogènes. Les bactéries coliformes sont présentes dans l'intestin des animaux à sang chaud, mais elles sont aussi présentes dans les sols, sur les débris végétaux, etc. Les bactéries coliformes qui peuplent l'intestin peuvent être identifiées par leur tolérance à une température de 44-45 °C. La présence de ces coliformes thermotolérants est une preuve indiscutable d'une contamination par matières fécales. Dans les eaux brutes, le nombre de coliformes est un indicateur de probabilité de la présence de bactéries pathogènes. Dans les eaux traitées, la présence de ces coliformes est un indicateur d'inefficacité du mode de stérilisation de l'eau.

Informations

• Nature des micro-organismes
Les bactéries coliformes sont des bactéries en bâtonnets, Gram négatifs, oxydase négatif, aérobies ou anaérobies facultatifs.
Les Coliformes thermotolérants sont ceux résistant à une température de 44°C, notamment le colibacille, Escherichia coli.
• Norme

0 pour 100 mL d'eau

 

Principe de la mesure

• On procède à la filtration sur membrane de 100 mL d'eau puis la membrane est mise en culture sur une gélose nutritive.

Matériel

• Matériel de stérilisation (four, autoclave ou autocuiseur).
• Etuve ou enceinte thermostatée 37°C +/- 1°C.
• Matériel de microbiologie : boites de pétri stériles petit diamètre, pipettes 1 mL stériles (usage unique), flacons stériles.
• Système de filtration sur membrane et membranes stériles, trompe à vide.
• Gélose au Tergitol 7.

Protocole

• Travail préparatoire
  • Préparation de la gélose et conservation.

  Suivre les indications fournies avec la gélose au Tergitol 7, stériliser en flacons de 100 mL à 200 mL.

   

  • En zone stérile

  Couler la gélose dans les boites de pétri petit diamètre. Laisser refroidir couvercle en partie ouvert. Quand la gélose est solide, fermer la boite et placer au réfrigérateur, gélose vers le haut.

   

• Stérilisation des flacons de prélèvement

Mettre du coton cardé (hydrophobe) sur l'embouchure, recouvrir de papier aluminium. Stériliser au four à 170°C pendant 1 heure ; à l'autoclave à 120°C pendant 20 min ; dans une cocotte minute contenant un peu d'eau pendant 40 minutes après la mise en rotation de la soupape.
• Stérilisation du système de filtration

Stériliser le système de filtration, ou seulement la partie supérieure qui recueille l'échantillon d'eau. Entourer la partie à stériliser de papier aluminium. Après stérilisation, conserver dans le papier aluminium.
• Prélèvement
  • Eau de rivière, de puits, etc.
  
  Attacher la bouteille stérile à une corde, lester. Maintenir la bouteille dans l'eau à la profondeur souhaitée. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium.
  • Eau du robinet.
  
  Nettoyer le robinet avec un tissu propre, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min. Stériliser à la flamme (briquet, lampe alcool) l'embouchure du robinet, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min.
  Remplir le flacon en laissant un peu d'air. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium. Conserver l'échantillon au réfrigérateur, ensemencer le plus vite possible.
• Filtration sur membrane
  • Préparer une zone stérile : placer autour du bec Bunsen les boites de pétri avec gélose au Tergitol 7 et les pipettes stériles.
  • Placer la membrane stérile sur le système de filtration.
  • Mettre en place la trompe à vide.
  • Agiter le flacon vigoureusement.
  • Verser 100 mL d'échantillon d'eau et filtrer en aspirant avec une trompe à vide.
• Ensemencement
  Mise en culture en zone stérile.
  Ouvrir le système de filtration et retirer la membrane avec une pince stérile.
  Déposer la membrane sur la gélose, face contaminée en haut. Les éléments nutritifs de la gélose traversent la membrane, ce qui permet le développement des bactéries en surface.
• Incubation
  Placer les boites à l'étuve à 37°C (incuber les boîtes couvercle vers le bas pour que la condensation s'accumule dans le couvercle) .
  Pour la recherche de coliformes, placer les boîtes à 37°C pendant 24 et 48 heures.
  Pour la recherche de coliformes thermotolérants, placer les boîtes à 44°C pendant 24 et 48 heures.
• Résultats
  • Identification des colonies et dénombrement
  
  Le dénombrement des bactéries repose sur le principe selon lequel une colonie se forme par divisions d'un seul micro-organisme.
  Examiner la membrane à la fin de l'incubation, à travers le couvercle.
  Pour des raisons de sécurité, ne jamais ouvrir la boîte.
  Coliformes : sont considérées comme caractéristiques les colonies qui présentent une coloration jaune orangé.
  Coliformes thermotolérants : sont considérées comme caractéristiques les mêmes colonies que pour les coliformes, mais après incubation à 44°C.
  Compter les colonies en marquant chaque colonie sur le fond de la boîte avec un marqueur indélébile.
  • Lisibilité
  
  Est considérée comme lisible une membrane où sont présentes au plus 100 bactéries. Si le nombre est supérieur, il faut procéder à des dilutions (se référer à la technique présentée pour le dénombrement des microorganismes revivifiables).
  • Calcul
  
  Exprimer le résultat en nombre de bactéries par 100 mL. Tenir compte de la dilution éventuelle.
• Décontamination

Ouvrir les boîtes au laboratoire, les décontaminer à l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes ou dans l'eau de Javel diluée (un berlingot de 250 mL complété à 1 L avec de l'eau distillée) pendant 24 heures.